多亏了冷冻电子显微镜,解决分子结构达到原子级分辨率的可能性现在已成为晶体学的一种切实可行的替代方法。 cryo-EM将极大地改变研究蛋白质及其与原料药相互作用的方式

低温电子显微镜(cryo-EM)是一项非常年轻的技术,具有巨大的潜力,可以帮助增加3D复杂大分子(例如蛋白质)的结构知识;如此巨大以至于被评为“ 2015年度方法” 1 根据 自然方法.

所谓的“单粒子cryo-EM”可用于确定单个大分子的结构,直至原子能级分辨率(2-3Å):十年前还无法想象这一结果。极大地有助于阐明与其他生物分子或与药物的相互作用。

这个怎么运作

结构生物学的革命始于2012年至2013年,当时出现了第一批用于冷冻EM的商业仪器。从那以后,文献中的科学文章数量成倍增加。

该技术本身诞生于1968年,是David De Rosier e Aaron Klug的作品2但是,只有在发明了“玻璃冰”技术来制备分析样品后,cryo-EM的真正潜力才更加清楚地显现出来。3。 (70S核糖体的)第一个单颗粒3D结构的分辨率为11.5Å3 在2000年由Joachim Franck创作。在2015年,分辨率极限已超过3Å:“分辨率”一词在专家小组的最近一次演讲中得到了解释。4 网络研讨会对于传统的X射线晶体学,在冷冻EM中具有非常独特的意义。对于所研究的大分子不同区域获得的分辨率可能会略有不同,因此分辨率是指整个结构的平均值。公布了以2,2Å分辨率测定b-半乳糖苷酶的冷冻EM结构5 在2015年由Subramaniam指导的美国国家癌症研究所的研究小组进行研究;结果代表了观察分子细节的第一个例子,例如单个氨基酸及其侧链,水分子或未嵌入蛋白质三级结构的金属离子。该技术还可以表征分子结构的动态效应。

cryo-EM方法的主要优点是可以直接在水溶液中使用样品,因此可以随意移动。仅2 µl的溶液就足以对150kDa最小尺寸的蛋白质进行该过程。网络研讨会期间,布里奇特·卡拉格(Bridget Carragher)(国家自动分子显微镜国家资源,NRAMM)表示,未来几年,尺寸限制可能会减小到100 kDa。沉积在分析载体上并除去多余的液体后,将样品用液态乙烷冷冻,产生“玻璃状冰”。整个过程由cryo-EM设备自动运行,并且这种材料的特性与正常的冰晶完全不同。

插入低温电子显微镜后,垂直的电子束穿过样品,并产生摄影图像(每秒高达400克),其中光和影区域代表真实粒子在图像上的几何投影。飞机。观察到的二维几何图案代表了水溶液中分子的所有可能取向。然后,由于软件具有更好的信噪比,代表相同投影的单个摄影图会自动进行分组,并相加以获得更高分辨率的图像。

为了获得高分辨率图像,重要的是平衡电子束的强度和避免破坏蛋白质结构的需要。一旦,对于每个投影,已经获得了最佳视图,则将不同的视图相加以获得三维结构。据霍华德·休斯医学研究所和加利福尼亚大学旧金山分校的研究人员郑一凡表示,在网络研讨会期间,大约需要300-500,000个分子,以实现3Å的最终分辨率。直接检测设备(DDD)是通过捕获电子而不是光子来获取图像的新兴技术。整个过程是自动化的,由NRAMM的专家开发的开源软件(即Leginon和Appion)可用于支持数据的采集和制作6.

该方法的优点和应用

与经典X射线衍射相比,cryo-EM可以对难以结晶的蛋白质,蛋白复合物或具有不同构象的底物进行结构测定。也有可能观察到正在研究的分子内发生的动态运动。就药理学应用而言,一个很大的优势是可以高精度鉴定单个氨基酸残基及其配体,以及氢键和分子间的相互作用。 Sriram Subramaniam解释说,在大分子上工作的可能性使cryo-EM与核磁共振技术具有竞争优势,而核磁共振技术对小的底物特别有用。

Cryo-EM在阐明病理机制方面具有巨大潜力,可以帮助及早发现和选择候选药物以及确认病理学靶标。 Sriram Subramaniam认为,病毒学,神经科学,肿瘤和免疫学是最有前途的应用领域

Cheng Yifan Cheng的小组发表了膜通道TPVR1的结构特征,该膜通道被辣椒素,热和抗炎药激活,并在疼痛的基础上激活了部分生化途径。在2013年发布8Å分辨率的结构后8,使用启用剂量分馏的运动校正技术将其精确度提高至3.4Å,从而可以准确识别参与孔形成的残留物。

Subramaniam研究小组已经研究了β-半乳糖苷酶抑制剂(例如PEGT)的结合位点。研究人员还研究了动态酶,例如谷氨酸受体9,其特征在于非常高的构象性和镁离子通道,类似于五边形10。当镁离子的浓度低时,这消失了:观察到的巨大构象变化破坏了分子的对称性。

药物设计也可能会受益于cryo-EM,例如通过阐明动态酶p97的变构抑制机制来证明这一点,该分子是国家癌症研究所抗肿瘤途径的一部分,11。在2.3分辨率下进行结构测定,可以鉴定一些关键侧链的构象变化,抑制剂的结合位点以及源自ATP和ADP分子结合的构象变化。

未解决的问题

cryo-EM仪器的高成本是主要的进入壁垒,目前这限制了该技术在全球仍很少的专业实验室之外的广泛可用性。建立中央服务提供商似乎是许多国家的首选方法,这与过去粒子加速器的做法类似。英国的生物影像中心(eBIC)和荷兰的电子纳米检查中心(NeCEN)是欧洲范围内这种方法的一些例子。我们在包装盒中报告了即将在意大利安装的首台cryo-EM。 NRAMM和霍华德·休斯医学院(Howard Hughes Medical Institute)于2006年建立的Janelia研究园区,是美国低温EM的主要中心。

在这个新兴的结构分析领域,仍然没有指导或最佳实践可以帮助研究人员开展工作。迈克尔·爱森斯坦(Michael Eisenstein)在《科学》杂志的一篇文章中指出,原始数据的发布也应达成标准化共识。 自然方法4.

意大利第一台低温电子显微镜

 肉酱
马蒂诺·博洛涅西

米兰大学(Statale)于2016年6月宣布,收购了意大利第一台单粒子低温电子显微镜。该计划代表了整个意大利科学界迈出的非常重要的一步,以在全球结构生物学框架内保持竞争地位。

马蒂诺·博洛涅西 是米兰大学结构生物学系的负责人,将主持新仪器。 «我们从2014年秋天开始讨论这种可能性–他告诉《制药世界》。 –我们意识到电子显微镜正在取得历史性突破;这与我们所进行的蛋白质和大分子晶体学研究相融合。大学对科学进步的认识以及我们从Fondazione Invernizzi那里获得的资助使该程序得以启动,我们预计新仪器将在2017年初安装»。 cryo-EM设备也将能够进行电子冷冻断层分析,这适用于相对于cryo-EM以及整个细胞更大的分子复合物。

该业务的全球价值为350万欧元,每年的运营成本估计为10万欧元。新的低温电子显微镜将安装在经过优化的特殊建筑中,以减少振动并抑制磁场。新中心将为米兰大学的所有研究人员以及意大利结构生物学界的其他科学家提供服务。 “我们开始运营时,与该地区的其他大学和研究中心(即圣拉斐尔医院,Humanitas,国家分子遗传学研究所和国家研究委员会)进行了联系。博洛涅西进一步告诉我们,他们都对我们的倡议表现出了浓厚的兴趣。米兰大学将发布一项特定法规,以建立使用该仪器的规则。例如,可以将服务作为样品的简单测量来提供,从而产生原始数据,然后应由用户直接进行分析。 «更密集的服务可能还包括对所获取图像的分析。我们的兴趣是该仪器每周7天可以在H24上运行。结构生物学部主任解释说,我们将对行政和运营成本进行深入分析,以确定服务的收费标准。

博洛涅西教授还参与了运行新型低温电磁仪器所需的高度专业化的人力资源的选择。这些能力是相当新的,它们既可能来自米兰大学内部,也可能来自新开设的副教授职位,因此正在甄选候选人。

结构生物学系的研究人员主要从事分子量大于100 kDa的大分子和多蛋白复合物的研究。 «我们对新仪器的研究将集中于新药的开发。博洛涅西告诉记者,例如,蛋白质和膜的复合物是目前市场上最活跃的医药产品的30-40%的目标»。这种生物大分子很难结晶,因此可能需要就调节剂,药物或细胞应激条件的作用进行研究。病毒蛋白也可能代表新病毒药物的靶标。 «单粒子cryo-EM的分离潜力是此类项目的选择方法。专家进一步解释说,还可以研究不需要原子分辨率的系统,例如脂质囊泡和亚细胞颗粒或转录复合物。

参考文献

  1. 自然方法 13,1(2016)doi:10.1038 / nmeth.3730
  2. 自然方法 13,19-22(2016),doi:10.1038 / nmeth.3698
  3. 生物物理学。 J., 110,4,756–757(2016),doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2015.07.049
  4. 细胞, 100,5,537-549(2000)doi: http://dx.doi.org/10.1016/S0092-8674(00)80690-X
  5. 细胞 , http://view6.workcast.net/?pak=8410947634419202
  6. 科学 ,348,1147-1151(2015), http://dx.doi.org/ 10.1126/science.aab1576
  7. http://nramm.nysbc.org/nramm-releases-leginon-and-appion-version-3-1/
  8. 性质 504,113–118(2013) http://dx.doi.org/ 10.1038/nature12823
  9. 性质 , 514,328-334(2014), http://dx.doi.org/10.1038/nature13603
  10. 细胞164, 747-756(2016),doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.12.055
  11. 科学,351, 871-875(2016), http://dx.doi.org/ 10.1126/science.aad7974

 

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